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“疾病Hi-C”帶您突破精準醫療


        Hi-C技術源于染色體構象捕獲(Chromosome Conformation Capture—3C)技術,以整個細胞核為研究對象,利用高通量測序技術,結合生物信息學方法,研究全基因組范圍內整個染色質DNA在空間位置上的關系,揭示染色體的三維結構。2015年,美國國立衛生研究院(NIH)宣布,將人類染色體的三維結構研究方向視為進一步認知疾病的重大機遇,并批準立項為共同基金重大項目,即“3D 核小體”(3D-Nucleome)計劃;2016年,中國啟動精準醫療計劃,國家科技部發布“精準醫學研究”國家重點研發專項??杉鸋i-C加入到疾病研究中是突破精準醫療的重要方向。

        之前疾病研究多集中于基因組、轉錄組和表觀組層面,大家關注基因突變、表觀修飾對于疾病的影響。近幾年,染色體三維結構(Hi-C)作為嶄新的研究方向,在疾病研究中的地位越來越重要,高分文章層出不窮,如表1。

表1 Hi-C在疾病中的文章發表情況

年份
期刊
影響因子
研究問題
2016年
Genome Research
11.351
Hi-C研究前列腺癌發生機制
2016年
Cell
28.71
捕獲Hi-C研究類風濕性關節炎、
1型糖尿病和Crohn氏病等自身免疫疾病
2016年
Nature
38.138
Hi-C研究X染色體沉默機制
2015年
Cell
28.71
Hi-C研究手指畸形機制
2015年
Genome Research
捕獲Hi-C研究乳腺癌發生機制
2015年
Genome Biology
10.81
Hi-C研究乳腺癌發生機制
2014年
Nature Communication
11.47
捕獲Hi-C研究結直腸癌發生機制

一、疾病Hi-C技術參數
1. 材料選擇:

    疾病細胞/組織以及正常細胞/組織。
2. 測序策略:
    建議分辨率40kb及以上,Illumina HiSeq PE150測序
3. 疾病Hi-C多組學研究策略:

圖1疾病Hi-C多組學研究策略

二、案例解析
案例1:Hi-C研究乳腺癌發生機制

        本篇文章發表在Genome Biology上(IF=10.81),選取人乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MCF-7 ,文章思路簡單清晰,主要是在不同分辨率下進行染色體三維結構的比較。

1. 樣本選擇:
    本文選取兩種細胞系即人乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MCF-7。
2. 文庫及測序策略:
    文庫:Hi-C文庫+轉錄組文庫
    測序策略: RNA-seq:HiSeq 2000 SE100
    Hi-C:HiSeq 2000 PE100
3. 研究思路

圖2 文章研究思路

4. 研究結果展示
11M分辨率下人乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MCF-7在染色體互作上的差異
        通過染色體相互作用熱圖比較,肉眼是很難尋找二者的差異,或者說觀察到的差異不明顯,本文采取“減法”算法,巧妙地將兩個細胞系的互作熱圖整合到一張圖中,結果發現在小染色體中(16-22號染色體),MCF-10A細胞系中有較強的基因相互作用。


圖3 MCF-10A和MCF-7中16-22號染色體間相互作用比較

2A/B compartment 差異分析
        之前的研究表明,基因組內的相互作用有兩種模式:開放區((A-type)和封閉區((B-type)。在乳腺癌細胞系MCF-7和乳腺上皮細胞系MCF-10A基因組中鑒定出了這兩種區室,MCF-10A、MCF-7的開放和封閉區域分布大體上非常相似,只有一些區域有A到B區室或者B到A區室的轉化。這些轉化區域中的很多基因和癌癥重要通路WNT相關。


圖4 A/B compartment 差異分析

3TAD差異分析
       MCF-10A和MCF-7基因組中大規模染色體相互作用差異和改變的基因區室內是否會對TAD形成和基因表達造成影響是未知的。為解決這個問題,用40kb分辨率來鑒定TAD邊界,發現一些TAD邊界是乳腺癌細胞系特有的。


圖5 TAD差異分析

案例2:捕獲Hi-C研究類風濕性關節炎、1型糖尿病和Crohn氏病等自身免疫疾病

       本篇文章是2016年11月18號由英國Babraham研究所Peter Fraser博士研究團隊發表在Cell上,Babraham研究所一直專注于捕獲Hi-C方法的研發和應用,文章先后發表在Genome Research、Nature Genetics上。

1. 樣本選擇:
     17種不同類型的血細胞,含有Naive CD4+ T cells、Megakaryocytes、Neutrophils等自身免疫疾病相關的細胞系。
2. 文庫及測序策略:
     文庫: Hi-C、Capture Hi-C
     測序策略:Illumina HiSeq2500
3. 研究結果:
       通過對17種不同類型的血細胞中與基因相互作用的調控元件調查,本文建立起了在各個細胞類型中調節特定基因的遠程調控元件的集合。遠程調控元件區域的一些微小變化,會干擾基因的正常調控,導致特定疾病的發生。本研究發現了成千上萬與特定疾病相關的新基因,包括類風濕性關節炎、1型糖尿病和Crohn氏病等疾病。


圖6 捕獲Hi-C揭示疾病相關機制

案例3:Hi-C揭示手指畸形機制

本篇文章發表在Cell上,采用的測序技術種類以及樣本豐富程度都是第一篇乳腺癌文章達不到的。

1. 樣本選擇:
     手指畸形病人的血液樣本、皮膚組織樣本,野生小鼠胚胎干細胞、CRISPR編輯后的突變小鼠模型。
2. 測序技術種類:
     Hi-C、4C-seq、人全基因組測序、外顯子測序、RNA-seq、ChIP-seq等。
3. 研究思路
       本文從病人樣本出發,采取人重測序尋找手指畸形對應的染色體變異,接著采取小鼠模型驗證染色體變異是否引起染色體三維結構的變化,最終回歸病人樣本揭示手指畸形的機制。發現是染色體變異(缺失、復制、倒位)引起了染色體三維結構的變化,使原來的TAD邊界被打破;從而遠程調控元件與目的基因間的互作發生改變,引起基因表達水平改變,造成手指畸形。


圖7 研究思路

4. 結果展示:
1)人重測序尋找手指畸形相關的染色體變異
       對手指畸形病人血液樣本進行人全基因組重測序,發現在三種手指畸形中均有相應的染色體變異發生。 短指:染色體缺失,包含EPHA4 PAX3 非編碼區的一端區域,并指:染色體倒位和區域復制,多指:染色體區域復制。


圖8 手指畸形樣本的染色體變異情況

2CRISPR 方法構建手指疾病的相關小鼠模型,探究染色體變異引起的染色體三維結構變化
       在小鼠模型中用4C-seq發現染色體重排導致異常表達的基因與含有Epha4 的TAD產生新的相互作用,即染色體變異引起染色體三維結構發生變化(TAD的邊界改變)。 此外,本文返回到病人樣本,短指、多指、并指病人成纖維細胞4C-seq結果與小鼠手指4C-seq和人Hi-C結果高度相似,在病人細胞系中已破壞的TAD導致相互作用異常。


圖9 染色體變異引起染色體三維結構變化

3 TAD邊界改變導致遠程調控元件和目的基因相互作用發生變化
       結合已有的ChIP-seq數據發現,邊界發生變化的TAD中含有重要的增強子,這些增強子與相鄰TAD內的基因有異常的互作,導致調控紊亂,造成手指畸形。


圖10 增強子與基因互作紊亂

參考文獻:
[1]Taberlay P C, Achingerkawecka J, Lun A T, et al. Three-dimensional disorganisation of the cancer genome occurs coincident with long range genetic and epigenetic alterations.[J]. Genome Research, 2016.
[2]Javierre B M, Burren O S, Wilder S P, et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters[J]. Cell.
[3]Giorgetti L, Lajoie B R, Carter A C, et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse.[J]. Nature, 2016, 535(7613).
[4]Lupiáñez D G, Kraft K, Heinrich V, et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.[J]. Cell, 2015, 161(5):1012-25.
[5]Dryden N H, Broome L R, Dudbridge F, et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C.[J]. Genome Research, 2014, 24(11):1854-1868.
[6]Barutcu A R, Lajoie B R, Mccord R P, et al. Chromatin interaction analysis reveals changes in small chromosome and telomere clustering between epithelial and breast cancer cells[J]. Genome Biology, 2015, 16(1):1-14.
[7]Jäger R, Migliorini G, Henrion M, et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci[J]. Nature Communications, 2015, 6.


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