做CRISPR,用這個工具會讓你事半功倍![新品推薦]

【字體: 時間:2016年04月15日 來源:聯川生物

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  CRISPR-Cas9特異性取決于前20 bp的sgRNA,因而存在一定的脫靶效應。所以開展CRISPR研究,需要合成相當數量的sgRNAs。如果采用傳統方式合成大量sgRNAs,不僅合成費用高,而且合成效率低??蒲腥嗽奔斃杈酶咝У拇蠊婺:銑曬押塑賬嶁蛄形目獾姆槳?,幫助他們更便利地開展CRISPR工作。

CRISPR改變游戲規則的技術

1987年,一個日本研究小組在研究大腸桿菌時發現其K12堿性磷酸酶序列附近有成簇的短間隔重復序列。當時研究人員并不清楚這些序列的生物學意義。

然而,三十年后的今天,這個不起眼的“小發現”卻綻放出了耀眼光芒,因為科學家們正是利用這個小片段找到了一種可以對多種生物的基因組進行遺傳改造的工具,特別的是,這種方法操作起來非常地簡單。這個簡便又實用的基因組改造新技術稱為CRISPR-Cas系統。


 
圖1 CRISPR原理

成簇的規律間隔的短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences),即CRISPR序列,這就是日本科學家當年發現的那個序列。研究發現,這些CRISPR序列與很多病毒或者質粒的DNA序列是互補的,說明這套CRISPR-Cas系統很有可能是生物體抵御病毒等外來入侵者的一套特異性防御機制,就好像是另外一套適應性免疫反應系統。

自2013年起,CRISPR的相關研究呈爆發式增長,人們開始將CRISPR應用于各個領域,如構建特定突變基因的模式生物,對某些遺傳性致病突變進行修飾,甚至是最近大熱的Car-T技術等。CRISPR-Cas9是目前應用最廣的基因編輯系統之一,這套系統僅含有一個Cas9蛋白和一段20 bp的single guide RNA(sgRNA),sgRNA用于識別目的序列,Cas9指導前體crRNA(CRISPR RNAs)的成熟、外源DNA降解和質粒降解。crRNA通過堿基配對與trans-activating RNA(tracrRNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物。此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA,造成DNA雙鏈斷裂,引起體內細胞修復機制:插入缺失(InDel)引起的非同源末端連接(non-homologous end joining)與同源重組(homologous recombination)修復機制。

CRISPR-Cas9特異性取決于前20 bp的sgRNA,因而存在一定的脫靶效應。所以開展CRISPR研究,需要合成相當數量的sgRNAs。如果采用傳統方式合成大量sgRNAs,不僅合成費用高,而且合成效率低??蒲腥嗽奔斃杈酶咝У拇蠊婺:銑曬押塑賬嶁蛄形目獾姆槳?,幫助他們更便利地開展CRISPR工作。

OligoMix®為大規模寡核苷酸文庫合成而生
 

聯川首席科學家高曉連教授是世界上最早提出采用超大規模合成技術(原位合成基因芯片技術)進行人工基因合成概念的科學家?;詿爍拍?,2004年高曉連教授與哈佛大學George Church合作的光化學原位合成基因芯片進行快速合成有活性的基因的研究成果已發表在國際頂尖期刊《Nature》上。

OligoMix®是為滿足研究人員使用混合寡核苷酸(pooled oligonucleotides)進行多種不同應用而研發的產品?;諏ň哂兇災髦恫ǖ?micro;Paraflo®微流體芯片平臺,可以一次性平行地合成數千條不同序列組成的寡核苷酸,寡核苷酸合成采用標準的DMT化學法,保證了寡核苷酸的高產量和高質量。據測算,OligoMix®可以比傳統堿基合成技術節省了近20倍的支出和時間。

聯川Oligomix®早已被研究人員成功應用于基因合成,文庫構建,新藥發現,以及靶向捕獲探針制備等諸多應用領域。


OligoMix®成功扮演CRISPR的Guide RNAs

在CRISPR-Cas9突變篩選中,研究人員需要將能夠靶向成千上萬個基因位點的guide RNAs克隆到病毒載體中,然后“投遞”到靶向細胞中。通過鑒定guide RNAs在設定表型細胞中的富集情況,研究人員能夠系統并快速地鑒定與特定表型相關的基因。為了使大規模篩選試驗成為可能,就需要大規模合成guide RNAs。

OligoMix®正為那些希望大規模合成guide RNAs文庫的研究人員提供了一套獨一無二的解決方案。研究人員可以快速合成包含數千條完全定制化的序列文庫,這些特異性單鏈寡核苷酸序列可識別基因組中特定的區域。

下面舉幾個OligoMix®作為CRISPR Guide RNAs的成功應用案例

Nat Biotechnol (2016) High throughput mapping of regulatory DNA.(IF=41.514)


 
圖2 MERA實驗方案

來自MIT(Gifford實驗室)和Brigham and Women’s Hospital的研究人員證實,OligoMix®合成的guide RNAs文庫在MERA技術中具備有效性。MERA技術全稱是Multiplexed Editing Regulatory Assay,即基于CRISPR-Cas9的多重基因編輯調控實驗的篩選方法。

Genome Res (2016) A new class of temporarily phenotypic enhancers identified by CRISPR/Cas9-mediated genetic screening.(IF=14.630)


 
圖3 鑒定順式調控元件的高通量CRISPR/Cas9介導篩選方案

Ludwig Institute for Cancer Research任兵教授團隊以Oligomix®作為Guide RNAs,成功開發出一種基于CRISPR/Cas9基因組編輯的高通量篩選技術,可用于功能性篩選人類基因組中的順式調控元件。研究團隊將這一策略用于人類胚胎干細胞中POU5F1基因上,不僅揭示出一些經典的順式調控元件,還發現一類非常規的調控元件。這些非常規的調控元件能夠以一種意想不到的方式進行轉錄調控。

Methods Enzymol (2014) Adapting CRISPR/Cas9 for functional genomics screens.


 
圖4 sgRNA文庫合成與混合篩選策略

McGill University研究人員證實將寡核苷酸庫(Oligomix®)克隆到逆轉錄病毒表達載體,可同時傳遞Cas9核酸酶和sgRNAs。這種方法為高通量功能基因組篩選提供了穩定和可重復性表達的基因編輯工具。

更多OligoMix®在CRISPR-Cas9中的前沿應用等你來實現!

參考文獻
1.Gao X, Church, GM, et al. (2004) Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA chips. Nature 432,1050-1054.
2.Rajagopal N, Srinivasan S, Kooshesh K, Guo Y, Edwards MD, Banerjee B, Syed T, Emons BJ, Gifford DK, Sherwood RI (2016) High throughput mapping of regulatory DNA. Nat Biotechnol 34(2):167-74.
3.Diao Y, Li B, Meng Z, Jung I, Lee AY, Dixon J, Maliskova L, Guan KL, Shen Y, Ren B.(2016) A new class of temporarily phenotypic enhancers identified by CRISPR/Cas9-mediated genetic screening. Genome Res 26(3):397-405.
4.Malina A, Katigbak A, Cencic R, Maïga RI, Robert F, Miura H, Pelletier J. (2014) Adapting CRISPR/Cas9 for functional genomics screens. Methods Enzymol546:193-213.

聯川生物為CRISPR研究人員提供大規模高性價比Guide RNA文庫合成服務

獲取更多用戶研究案例,請關注聯川微信公眾號或撥打0571-87662413。


 
關于聯川生物
聯川生物成立于2006年,經過多年的快速發展,已成為業界領先的多組學技術服務商。公司擁有具有自主知識產權的µParaflo®微流體定制化芯片平臺,可以為科研用戶提供從基因組,轉錄組,到蛋白組的高通量定制化表達譜芯片解決方案。我們是全球首家提供microRNA表達譜芯片分析的服務商。作為國內最早提供高通量測序技術服務的公司之一,聯川生物擁有經驗豐富的技術團隊和一流的生物信息學專家組,可以為研究人員提供多組學測序服務和深度個性化數據分析解決方案。為滿足研究人員跨組學高通量研究需求,聯川生物已將蛋白質組定量分析引入技術服務線,為用戶提供貫穿中心法則的全程解決方案。多年來,聯川生物一直與國內的科研團隊保持著長期緊密的合作,助力科研人員在生物、醫學、和農林領域的科學發現。全球科研用戶使用聯川生物的優質科研服務和高質量組學實驗數據已發表了逾600篇高水平研究論文,其中已在Cell,Nature,Science系列頂級期刊上發表論文22篇。

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