循環游離DNA也能直接建庫了[新品推薦]

【字體: 時間:2016年06月28日 來源:生物通

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  如今,人們通常利用新一代測序(NGS)技術對cfDNA進行高通量分析,看看哪些基因有突變,并根據突變信息來確定下一步的診療方案。從理論上說,這是一種簡單易懂的方法,不過,血清或血漿中的cfDNA濃度極低,這為測序文庫的制備帶來了挑戰。

血清或血漿中的游離DNA(cfDNA)正成為無創產前檢測(NIPT)或癌癥液體活檢的焦點。在癌癥檢測中,人們已發現癌癥患者的cfDNA數量和完整性與健康對照不同。這使得cfDNA有望成為癌癥診斷、預后和分層的生物標志物。

如今,人們通常利用新一代測序(NGS)技術對cfDNA進行高通量分析,看看哪些基因有突變,并根據突變信息來確定下一步的診療方案。從理論上說,這是一種簡單易懂的方法,不過,血清或血漿中的cfDNA濃度極低,這為測序文庫的制備帶來了挑戰。

為此,QIAGEN開發出一種經過優化的文庫制備方案,融合了高效率的接頭連接和無偏向的文庫擴增,可確?;竦酶卟康撓胖什廡蛭目?,而只需要1 ng cfDNA。制備出的文庫可與靶向富集技術相結合,實現靈敏的突變檢測。

流程改進

cfDNA有兩個明顯的特征:首先,濃度極低,通常1 ml血漿中只能提取出1-100 ng cfDNA;其次,血漿或血清中的循環DNA大多以短片段存在,在180 bp左右。根據這些特征,GeneRead Library Prep Kit的操作進行了一些修改,省去了片段化的步驟。連接步驟中的接頭濃度有所降低,并使用Agencourt AMPure XP純化反應,去除接頭二聚體。

當然,在制備文庫之前,你要先從人類血清或血漿中純化出游離的DNA和RNA。很多文獻都采用了QIAGEN的QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit。它利用硅膠膜選擇性地結合目標核酸,可從血漿、血清和其他無細胞體液中高效純化游離核酸。樣品處理量可達5 ml,洗脫體積可在20–150 μl之間靈活選擇。

之后,利用10 μl cfDNA洗脫物,你就可以輕松地建庫了。整個流程大約在3小時內完成,而手工操作時間不到30分鐘。首先進行末端修復,加A尾,再連接接頭。之后利用Agencourt AMPure XP純化反應,去除接頭二聚體。接著是12個循環的文庫擴增,純化后即可得到高質量的NGS文庫啦。

單管操作

操作過程中需要使用到三個試劑盒:GeneRead DNA Library I Core Kit、GeneRead Adapters以及GeneRead DNA I Amp Kit。這些試劑盒與Illumina的儀器兼容。另外,QIAGEN也提供與Ion Torrent儀器兼容的試劑盒。不過,Agencourt AMPure XP磁珠需要單獨購買。

GeneRead DNA Library I Core Kit包含末端修復、加A尾和連接所需的緩沖液和試劑。與其他的文庫制備流程相比,快速的單管操作只需較少的回收步驟,極大程度減少了手工操作可能帶來的污染和失誤風險,節省時間和人力。

GeneRead DNA I Amp Kit含有創新的高保真預混液,其中包含用于擴增的GeneRead HiFi Polymerase。GeneRead HiFi Polymerase是獨特的、高度特異性的聚合酶,能夠準確擴增文庫DNA,錯配率低,序列偏差小。在標準的PCR擴增中,若DNA序列的AT或GC含量高,則擴增產物可能較少或沒有,導致錯誤的序列數據或NGS測序結果。GeneRead HiFi Polymerase與預混液中獨特的配方共同作用,能夠確保均一擴增GC含量高的基因組序列,以便在后續的測序實驗中獲得準確結果。

優質文庫

QIAGEN曾對文庫質量進行評估,發現幾乎100%的測序數據(reads)能定位到人類參考基因組,并且近100%是unique reads。高比例的unique reads代表了高的文庫轉換效率,也代表了文庫中高的序列多樣性。

這種cfDNA測序文庫與基于雜交的靶向富集相結合,也帶來了出色的覆蓋度。QIAGEN曾利用xGen® Pan-Cancer Panel,從文庫中富集127個突變基因。測序后發現,超過99%的reads都以0.2X平均覆蓋度覆蓋,而超過90%的reads以0.5X平均覆蓋度覆蓋。不同位置的目標區域也有著極其相似的平均覆蓋度。

這下,你信心大增了吧。通過GeneRead文庫制備的改良操作,即使是濃度極低的cfDNA,也能帶來優質、高產的文庫。(生物通 余亮)

了解QIAGEN的cfDNA直接建庫方案

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