CRISPR基因編輯后單核苷酸替換檢測,就是這么簡單!

【字體: 時間:2018年12月06日 來源:Takara

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  Guide-it™ SNP篩選試劑盒可通過簡便的酶分析法,在數百個細胞克隆中輕松篩選出發生了單核苷酸編輯的細胞克隆。這種檢測方法無偏好性,與Sanger測序法相比,同樣準確,但速度更快,可以4 hr完成檢測,不用苦苦等待測序結果。

基因編輯技術其中一個強大的應用,就是在特定的基因組位點導入核苷酸替換,去模擬與人類疾病相關的單核苷酸多態性(SNPs)或者產生終止密碼子以實現準確的基因敲除。那么,問題來了:應該如何從數以百計的克隆中篩選出一個對單核苷酸進行了編輯的細胞克隆呢?這對研究人員來說無疑是一個挑戰,尤其是在沒有相應的表型的情況下。然而Takara公司推出的Guide-it SNP Screening Kit可以充分滿足這個需求,讓您在數百個細胞克隆中輕松篩選出發生了單核苷酸編輯的細胞克隆。

Guide-it SNP Screening Kit是通過簡便的酶分析法來進行檢測的,可以在96孔板中快速識別出基因編輯后的細胞克隆。整個操作流程簡單快速,首先通過PCR擴增基因組靶標位點,之后使用識別特定結構的核酸內切酶進行酶切反應,然后讀取熒光值就可以完成單核苷酸替換檢測。無論所需要檢測的核苷酸替換類型、細胞克隆的合子型或者靶標位點的基因序列如何,都可以使用這個方法進行檢測。

以G>A替換(野生型鳥嘌呤編輯為腺嘌呤)為例,基因編輯后,分離單細胞并擴大培養成為克隆細胞系,提取其基因組DNA并進行PCR擴增,PCR產物會與兩條不同的互補寡核苷酸——displacement oligo(綠色)和flap-probe oligo (深/淺紫色)進行雜交。根據基因編輯的結果,Oligos與PCR產物雜交后會形成下圖兩種結構中一種。

當基因編輯成功發生時,雜交產物為double-flap結構,Double-flap結構由Guide-it Flap Detector識別檢出,Guide-it Flapase核酸酶特異性剪切并釋放出flap,從而產生熒光信號。當沒有發生基因編輯時,flap-probe oligo在靶標位點不會形成完全的堿基配對,會形成一個帶有缺口的結構(上面),這個結構不能被Guide-it Flapase核酸酶剪切,也就不會產生熒光信號。通過這種方式,使用Guide-it SNP Screening Kit檢測熒光信號就可以確認是否發生了預期的核苷酸替換。

也許,有人會問,這種檢測方法是不是有一定的偏好性呢,是否可以檢測所有可能的堿基替換呢?Takara利用Guide-it SNP Screening Kit在多個人類基因組位點對核苷酸替換進行檢測,樣品是從Coriell研究所獲取的野生型或者發生了所標明的核苷酸替換的純合子來源的基因組DNA,檢測結果表明,所有的堿基替換均可以成功檢測到,與野生型(橙色)和陰性對照(灰色)樣品所獲得的熒光信號相比,發生了所標明的核苷酸替換的純合子(藍色)樣品產生了強熒光信號就可以說明這一點。

對此,Takara科學家也將這種檢測方法與Sanger測序法進行了比較。他們分別使用了Guide-it SNP Screening Kit(柱形圖)和Sanger測序法對來自于Coriell研究所的SNPs樣品進行分析,這些樣品在NCP1或者CFT基因組位點上攜帶了SNPs。Guide-it SNP Screening Kit可以準確分析確定哪些樣品發生了單核苷酸替換,這些樣品是純合子還是雜合子。所有檢測結果與Sanger測序結果是一致的(Sanger測序結果顯示在柱形圖下面)。

Guide-it SNP Screening Kit可以與Sanger測序法相媲美,并且,與Sanger測序法相比,Guide-it SNP Screening Kit卻擁有更快的速度,它可以4 hr完成檢測,不用苦苦等待測序結果。

這樣的檢測方法很簡單,無需進行測序也可以輕松檢測出基因組中的單核苷酸替換突變。不論您的研究領域是CRISPR單核苷酸替換編輯還是高通量SNP篩選,Takara公司的Guide-it SNP Screening Kit都可以讓檢測變得簡單起來。

更多詳細信息請點擊:Guide-it™ SNP Screening Kit                                          

 


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